接近遺傳密碼符號(hào)擴(kuò)增的生物合成方法：非自然DNA堿基對(duì)的分子設(shè)計(jì)

• 2016-01-22
• PC

1.簡(jiǎn)介

2010年, Craig Venter's 團(tuán)隊(duì)報(bào)道了一種新興的含有一個(gè)人工合成具有1.08 M 堿基基因組的支原體細(xì)菌。1這個(gè)成就是化學(xué)家和生物學(xué)家協(xié)作努力通過五年研究出來的結(jié)果。初始細(xì)胞的生成需要很大的努力，一旦制得人工細(xì)胞，他們就會(huì)像自然細(xì)胞一樣增殖。因此，人工設(shè)計(jì)的細(xì)胞可以合理的成本再生，用作合成有用蛋白質(zhì)和其他材料的生物工廠?，F(xiàn)有的生物系統(tǒng)的重復(fù)設(shè)計(jì)是一個(gè)合成生物學(xué)途徑的例子。2

 另一合成生物學(xué)方法的類型是構(gòu)建一個(gè)新的生物系統(tǒng)，用最新的生物組分來建造。在這個(gè)方法中，新的人造組分用于開發(fā)服務(wù)于某個(gè)目標(biāo)，在生物系統(tǒng)中他們與側(cè)邊的自然組分一起運(yùn)作。新的組分由重復(fù)的“proof of concept”試驗(yàn)創(chuàng)建。原型組分基于某個(gè)概念或者主意設(shè)計(jì)，并根據(jù)物理和生物實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行改進(jìn)。在這里，我們通過對(duì)DNA遺傳密碼符號(hào)擴(kuò)展的非自然堿基對(duì)的創(chuàng)建，描述這種類型的生物合成方法。3-8

2. 非自然堿基對(duì)的發(fā)展

地球生命遺傳信息在DNA序列中有四個(gè)不同堿基對(duì)編碼，腺嘌呤(A),鳥嘌呤(G), 胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)。DNA雙鏈分子中，A選擇性的與T配對(duì)，G與C配對(duì)。堿基配對(duì)原則是基本的通過復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯的遺傳信息流。因此，DNA中引入一個(gè)人為創(chuàng)建的堿基對(duì)可以增加遺傳字母，擴(kuò)大遺傳信息，提供一個(gè)新的生物技術(shù)能夠與特定的新組分結(jié)合為核酸和蛋白質(zhì)(Figure 1)。9此外，最近的利用人工堿基在復(fù)制和轉(zhuǎn)錄方面的研究已經(jīng)顯示出新的分子相互作用和生物反應(yīng)機(jī)理，僅僅通過自然組分利用生物分子標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行饞鬼分子觀測(cè)不出來。而且，人為的提高生物系統(tǒng)遺傳密碼符號(hào)對(duì)于化學(xué)家來說是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。

最重要的問題是，費(fèi)自然堿基對(duì)(X-Y) 作為三分之一的堿基對(duì)具有很高的特有的選擇性，也就是說，X選擇性與Y配對(duì)，與此同時(shí), A-T和G-C在生物系統(tǒng)中配對(duì)(Figure 2)。在復(fù)制中，DNA聚合酶結(jié)合底物與模板鏈之間部分雙鏈DNA片段。隨后，5'-三磷酸何干(dNTP, substrate)進(jìn)入DNA聚合酶絡(luò)合物。當(dāng)基質(zhì)在模板中與正確的伙伴配對(duì)，然后引物3'-羥基基團(tuán)的氧原子進(jìn)攻基板三磷酸α 位置。這個(gè)結(jié)果導(dǎo)致在引物和導(dǎo)入物之間形成磷酸雙酯鍵，并且釋放出焦磷酸做為一個(gè)離去集團(tuán)。引物結(jié)合正確的基質(zhì)后，DNA聚合酶滑向模板DNA 鏈，下一個(gè)基質(zhì)結(jié)合發(fā)生。復(fù)制中自然堿基配對(duì)的選擇性非常的高。例如，大腸桿菌DNA聚合酶I的克列諾片段,10,000 次結(jié)合會(huì)出現(xiàn)一次不正確的結(jié)合，10也就是說克列諾片段每一次復(fù)制的自然堿基對(duì)選擇性為99.99%。

3. 自然堿基對(duì): A-T和G-C

 創(chuàng)建一個(gè)非自然堿基對(duì)，我們需要了解為什么A-T 和G-C 堿基對(duì)按照他們的化學(xué)、物理、生物狀態(tài)在復(fù)制中有如此高的選擇性。在A-T和G-C 配對(duì)中，嘌呤堿基(A or G)與嘧啶堿基(T or C)配對(duì),  兩個(gè)氫鍵用于A-T，三個(gè)用于G-C (Figure 3)。因此，每一個(gè)堿基對(duì)糖苷鍵的距離約為10.7-11.0 Å，并且雙螺旋DNA 分子具有規(guī)則的人字齒輪結(jié)構(gòu)。氫鍵在質(zhì)子予體殘基和質(zhì)子受體原子或殘基中間形成。A-T和G-C對(duì)之間，氫鍵模式各不相同，因此，A 與T, G 和C配對(duì)總是一種常規(guī)的螺旋結(jié)構(gòu)。

然而，最近的研究已經(jīng)表明, 在復(fù)制中氫鍵的形成沒有必要搭配正確的堿基對(duì)。

1995年，Eric  Kool 和他的同事們?cè)O(shè)計(jì)合成了一個(gè)疏水性非自然Z–F對(duì)，其中Z和F 的形狀分別模仿A 和T(Figure 4)。11-13 對(duì)于Z，A 中1- 和3-氮被碳替代，6-氨基被甲基替代。對(duì)于F，T中3-氨基被C-H替代，2-和4-酮基由氟原子替代。通常，一個(gè)氟原子質(zhì)子受體的能力低于酮十倍。Kool團(tuán)隊(duì)化學(xué)方法合成特定位置中含有Z 或F的 DNA 模板 ，以及他們的核苷三磷酸鹽(dZTP和dFTP)，作為底物在體外進(jìn)行復(fù)制實(shí)驗(yàn)。他們表明，大腸桿菌DNA聚合酶I的克列諾片段在模板中有效的結(jié)合了dFTP 和dTTP 成為DNA ，對(duì)立與Z 或A，也與dZTP 、dATP 對(duì)立與F或T合并。相比之下，dCTP 相對(duì)Z 和 dGTP相對(duì)F的合并效率較低。因此，疏水性非自然Z-F對(duì)在復(fù)制中作用，與A-T對(duì)兼容，這表明，復(fù)制中配對(duì)堿基之間形狀互補(bǔ)性重要于氫鍵互補(bǔ)性。14

通過聚合酶來識(shí)別，A 和G中的3-氮, C和T中的2-酮作為氫鍵受體對(duì)于小溝是很必要的，在聚合酶中與具體的氨基酸殘基相互作用(Figure 3)。15例如，缺失2-酮基的嘧啶類似物基質(zhì)在PCR中不能夠并入DNA ( P olymerase  C hain R eaction).16 Kool的Z堿基相對(duì)于嘌呤3-氮缺少氫鍵受體原子，因此，他們新近研發(fā)Q 堿基，其位置上有一個(gè)氮(Figure 4)。17克列諾片段被復(fù)制的Q-F堿基對(duì)比Z- F對(duì)更高效。其他的因素，比如基質(zhì)疏水性，基質(zhì)偶極距，相鄰級(jí)之間堆積相互作用，以及CH- π相互作用18，在復(fù)制中對(duì)于堿基對(duì)選擇性也很重要。

考慮到這些，目前為止非自然堿基對(duì)的各種類型已經(jīng)發(fā)展至此。下面的季節(jié)中么，我們將介紹具有代表性的非自然堿基對(duì)以及他們的發(fā)展進(jìn)程。

4.Benner團(tuán)隊(duì)的親水性非自然堿基對(duì)

在1980年代后期，Steven  Benner和他的同事們報(bào)道了四種類型的具有不同氫鍵幾何體的  非自然堿基對(duì)，這不同于A-T和G-C對(duì)。19, 20 其中一個(gè)典型代表就是6-氨基-2-ketopurine (isoG)和2-氨基-4-ketopyrimidine (isoC)間的堿基對(duì)，他們分別是G和C的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體(Figure 5)。19Benner團(tuán)隊(duì)證實(shí)了isoG-isoC對(duì)通過克列諾片段在復(fù)制中互補(bǔ)作用。此外，isoG基質(zhì)(isoGTP)并入RNA 相對(duì)于isoC 并入DNA 模板，通過T7 RNA聚合酶。21 此外，1992年，isoG-isoC對(duì)用于體外翻譯系統(tǒng)，通過一個(gè)短的化學(xué)合成mRNA(含isoC)和一個(gè)3-iodotyrosyl tRNA (含isoG) ,使得不標(biāo)準(zhǔn)氨基酸特定合并成為多肽。22

Benner團(tuán)隊(duì)這些開創(chuàng)性的研究對(duì)利用非自然堿基對(duì)的遺傳膨脹系數(shù)受到了很大的關(guān)注。然而，這些非自然堿基對(duì)仍有很多的缺點(diǎn)。比如，isoG堿基溶液中經(jīng)受keto-enol互變異構(gòu)化，isoG堿基與T烯醇化(Figure 5)。21 除了isoG的問題，isoC中的2-氨基,相當(dāng)于自然堿基的2-keto位置，降低與聚合酶的相互作用。21此外，isoC的核苷在水溶液中不穩(wěn)定，室溫下，四天以后水中中性環(huán)境下會(huì)有50% 的isoC核苷三磷酸分解掉。23盡管在isoC堿基位置3處(相當(dāng)于自然嘧啶堿基位置5處)引入甲基可以改良其穩(wěn)定性，然而 甲基-isoC  核糖核苷仍然易受其β-糖苷鍵差向異構(gòu)化作用，從β-轉(zhuǎn)換為α-形式。最近，Benner團(tuán)隊(duì)通過在位置3處引入一個(gè)硝基解決了這個(gè)問題,24 如下所示。

2005年, Benner團(tuán)隊(duì)通過利用一個(gè)改性的T 堿基，2-thiothymine (TS),替代T (Figure 5),  解決了isoG keto-烯醇互變異構(gòu)化的難題，用于isoG-isoC堿基對(duì)系統(tǒng)。25 TS中大尺寸的硫原子阻止了isoG形式中與烯醇的配對(duì), 但仍是沒有空間斥力的配對(duì)。這個(gè)策略類似于Kool的配對(duì)堿基鍵形狀適合概念，以及Harry 1988年報(bào)道的的非自然堿基對(duì)的概念，26 他利用一個(gè)改良的鳥嘌呤，6-thioguanine作為一個(gè)新的堿基。非自然isoG-isoC對(duì)與A-TS對(duì)在酶聚合鏈反應(yīng)中共同作用：isoG-isoC對(duì)的每一次復(fù)制選擇性達(dá)到98%，而isoG-isoC選擇性在沒有TS的幫助下每次復(fù)制達(dá)到93%。25然而，98%非自然堿基對(duì)選擇性對(duì)于復(fù)制來說是不夠的，并且非自然堿基對(duì)的保留率在PCR反應(yīng)擴(kuò)大DNA 片段的20周期中變?yōu)?7% (0.9820 =0.67)。因此，對(duì)于復(fù)制中非自然堿基對(duì)的實(shí)際使用中，每一次復(fù)制超過99% 的選擇性是必要的。

2007年，Benner團(tuán)隊(duì)改進(jìn)了非自然堿基對(duì)系統(tǒng)，并研發(fā)了P-Z 對(duì)，其在PCR擴(kuò)增中不需使用A-TS對(duì)(Figure 5)。24 不同于isoG，P堿基在溶液中不經(jīng)歷不良的互變異構(gòu)化。Z堿基中的硝基基團(tuán)由于其亞氨基的去質(zhì)子化，阻止了它的核苷衍生物的差向異構(gòu)化。雖然P-Z對(duì)選擇性當(dāng)時(shí)在PCR中為97.5% ，但是最近的報(bào)道表明優(yōu)化PCR 條件下改良的選擇性在99.8%。27

5. Romesberg團(tuán)隊(duì)的疏水性非自然堿基對(duì)

Kool的關(guān)于非氫鍵堿基對(duì)的開創(chuàng)性實(shí)驗(yàn)引發(fā)疏水性堿基對(duì)作為非自然堿基對(duì)的候選物。Floyd  Romesberg和他的同事開發(fā)了大量的疏水性非自然堿基對(duì)，在復(fù)制系統(tǒng)中檢測(cè)他們的能力。1999年，他們報(bào)道了一個(gè)疏水性異喹啉衍生物PICS(Figure 6)，其自我互補(bǔ)堿基對(duì)在雙螺旋DNA 片段中具有很高的熱穩(wěn)定性。28此外，PICS酶作用物與DNA酶結(jié)合通過克列諾片段與PICS在模板中相對(duì)應(yīng)。

不幸的是，在PICS 基板中參入PICS后，引物暫停延伸。這是因?yàn)镻ICS-PICS對(duì)的形狀對(duì)于常規(guī)DNA雙螺旋的空間來說太大了，其PICS 堿基相互堆疊，不允許聚合酶識(shí)別。因此，他們?cè)敱M的設(shè)計(jì)和合成了另外的疏水性非自然堿基對(duì)，并在復(fù)制中檢驗(yàn)了它們的能力。29-35

2009年，他們成功的開發(fā)了疏水性非自然堿基對(duì)5SCIS-MMO2和5SCIS-NaM (Figure 6)，他們的功能是作PCR擴(kuò)增中三分之一的堿基對(duì)。36, 37與之前的PICS–PICS對(duì)相比， 這些堿基對(duì)的空間互補(bǔ)形狀有所改進(jìn)。5SCIS–NaM 對(duì)在PCR中最佳的保真度達(dá)到99.8%，盡管它取決于周圍非自然堿基對(duì)的排列順序。這些疏水性堿基對(duì)通過T7 RNA 聚合酶在轉(zhuǎn)錄中也起作用。38 該團(tuán)隊(duì)還通過一個(gè)進(jìn)化工程技術(shù)設(shè)計(jì)出DNA聚合酶，通過采用突變聚合酶了解決復(fù)制中使用PICS-PICS 堿基對(duì)時(shí)聚合酶暫定問題。39

6. Hirao團(tuán)隊(duì)的一系列非自然堿基對(duì)

我們團(tuán)隊(duì)在1997年之后也研究了非自然堿基對(duì)。大量的“proof  of  concept”實(shí)驗(yàn)后，我們于201年開發(fā)出第一個(gè)非自然堿基，在2-氨基-6-dimethylaminopurine (x)和2-oxopyridine (y)之間(Figure 7)。40這個(gè)x-y設(shè)計(jì)包含兩個(gè)概念：Benner氫鍵模式(它不同于自然堿基對(duì)’s)和一個(gè)位阻效應(yīng)。這個(gè)x-y對(duì)具有兩個(gè)氫鍵，x 的2-aminopurine 部分通過一個(gè)類似的氫鍵作用與T 配對(duì)。因此，我們?cè)趚的6位置處添加一個(gè)巨大的二甲胺基團(tuán), 通過T中6-dimethylamino 基團(tuán)和4-keto基團(tuán)之間的空間位阻來排除x-T配對(duì)。與 T相反, y 具有一個(gè)氫鍵代替了keto 基。x-y 對(duì)功能在轉(zhuǎn)錄中具有很高的選擇性，T7RNA聚合酶混合y三磷酸基質(zhì)(yTP) 成為RNA,相對(duì)于x 在DNA模板中，具有高于95%的選擇性。

此外，我們通過用一個(gè)噻吩基替代二甲胺基改進(jìn)了非自然堿基對(duì)的形狀互補(bǔ)性。因此，我們開發(fā)了2-amino-6-thienylpurine (s)作為y的配對(duì)搭檔 (Figure 7)。41噻吩基的平面化比X二甲胺基更加有效的排除了與T 的錯(cuò)誤配對(duì)。此外，平面性增加了s 堿基與相鄰堿基在DNA  鏈中疊加的能力。相比x-y 對(duì)，s-y對(duì)在轉(zhuǎn)錄中的選擇性和效率都有了很大的改進(jìn) 不僅僅yTP 也包括yTPs的一些部分，通過T7 RNA聚合酶，比如biotin-和fluorophore-linked y 堿基，與RNA結(jié)合,相對(duì)應(yīng)于DNA模板中。42-442002年，通過結(jié)合特定的含有s–y對(duì)和一個(gè)E. coli體外翻譯系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄，我們成功的特定結(jié)合一個(gè)非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸，3-chlorotyrosine變?yōu)橐粋€(gè)蛋白質(zhì)。41 因此，s–y對(duì)可疑作為體外翻譯和轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中第三個(gè)堿基 。

我們?cè)噲D進(jìn)一步的改進(jìn)我們這些非自然堿基對(duì)。一個(gè)主要的障礙是s–y對(duì)復(fù)制中不足的選擇性。PCR的一個(gè)DNA含有s–y堿基對(duì)片段10個(gè)周期過后，大約有40%的非自然堿基對(duì)被自然堿基對(duì)所替代。每一次復(fù)制中s–y對(duì)選擇性是~95%(40%的替代，10周期PCR過后: 1−0.9510=~0.4)，因此，對(duì)于非自然堿基對(duì)復(fù)制中超出99% 的選擇性時(shí)必須的，一個(gè)非自然堿基對(duì)約~90% (0.9910 =~0.90)可保留。因此，我們嚴(yán)格的精煉堿基對(duì)之間的形狀互補(bǔ)，并設(shè)計(jì)了一個(gè)五元環(huán)核苷模型，imidazoline-2-one (z),45 代替六元環(huán)y，作為s的配對(duì)搭檔  (Figure  7)。此外，我們祛除了來自s-z對(duì)之間的含有氫鍵相互作用的原子和殘基，46 在7-(2-thienyl)imidazo[4,5- b]-pyridine (Ds)和pyrrole-2-carbaldehyde (Pa)之間開發(fā)了一個(gè)疏水性非自然堿基對(duì) (Figure 7, 參閱化學(xué)合成附錄)。47我們?cè)赑a 堿基上添加一個(gè)醛基，作為一個(gè)質(zhì)子受體用于聚合酶之間的相互作用。

Ds–Pa對(duì)的問題是self-complementary  Ds-Ds配對(duì)在復(fù)制中也有競(jìng)爭(zhēng)力的發(fā)生。也發(fā)現(xiàn)了Romesberg’s PICS–PICS對(duì)，在Ds合并含有  對(duì)立面的Ds時(shí)的擴(kuò)展停頓。幸運(yùn)的是，我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)改良過后的Ds三磷酸基質(zhì)，γ-amidotriphosphate, 選擇性的結(jié)合opposite Pa，但是結(jié)合opposite Ds之后顯示出大幅度的減少。47改進(jìn)過后的基質(zhì)合并，因?yàn)榛|(zhì)的amidopyrophosphate部分被祛除作為一個(gè)聚合作用中的離去集團(tuán)，DNA具有母磷酸二酯鍵合。為了PCR擴(kuò)增，我們除了Ds也使用A中的γ –amidotriphosphate，來降低dATP 相對(duì)Pa.的插入性錯(cuò)誤。2006年，我們使用A中的γ –amidotriphosphate和Ds，成功的完成了含有Ds–Pa對(duì)的高選擇性PCR擴(kuò)增，其中每一次復(fù)制Ds–Pa對(duì)的選擇性達(dá)到99%以上。一個(gè)偶然的失誤，我們通過處理三磷酸合成中間體意外的合成了γ -amidotriphosphates，5'-三磷酸酯環(huán)狀物，具有濃縮氨。

我們進(jìn)一步的改進(jìn)了Ds-Pa對(duì)，用硝基替代Pa中的醛基，因此設(shè)計(jì)了2-nitropyrrole (Pn)(Figure 7)。48 Pn的硝基通過硝基中的氧和A中的1-氮之間的靜電斥力可以減少A opposite Pa的插入性錯(cuò)誤。另外，我們?cè)赑n堿基4-位置處添加丙炔基，開發(fā)出 2-硝基-4-propynylpyrrole (Px) 作為Ds的配對(duì)搭檔(Figure 7)。49 丙炔基增加了疏水性，增強(qiáng)了聚合酶之間的相互作用。因此,Ds-Px對(duì)在PCR中的功能不需要γ –amidotriphosphates的援助。含有Ds-Px對(duì)的DNA 片段通過PCR 40周期后被放大108-fold，超過97%的Ds–Px對(duì)仍被保留在擴(kuò)大的DNA中。The selectivity of the Ds–Px對(duì)的選擇性在每次復(fù)制中達(dá)到99.9%以上，這是迄今為止非自然堿基對(duì)中最高的選擇性。50

7. 結(jié)論

在過去的20年中，非自然堿基對(duì)合成生物學(xué)有何快速的發(fā)展，各種非自然堿基對(duì)被研發(fā)出來(Figure 8)。4, 51-54 這些非自然堿基對(duì)被應(yīng)用在DNA和RNA分子特定的熒光標(biāo)記,42, 55 固定,43, 47 特定檢測(cè),56-60  和結(jié)構(gòu)分析61-63中。雖然非自然堿基對(duì)在翻譯中的應(yīng)用程序還在開發(fā)研制，22, 41但到蛋白質(zhì)合成技術(shù)開發(fā)應(yīng)用于非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸特定結(jié)合為蛋白質(zhì)這只是一個(gè)時(shí)間問題。先前的非自然堿基對(duì)的研究?jī)H限于體外實(shí)驗(yàn)。現(xiàn)在我們又幾種類型的非自然堿基對(duì)有可能用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。將來，利用非自然堿基對(duì)擴(kuò)增遺傳密碼符號(hào)竟會(huì)應(yīng)用到細(xì)胞，比如Venter's artificial cell, 有效的產(chǎn)生人造蛋白質(zhì)和細(xì)胞中跟蹤表達(dá)目標(biāo)基因。我們期望這一領(lǐng)域?qū)π律锛夹g(shù)有進(jìn)一步的發(fā)展。

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