脂質體毛細管電泳研究進展

• 2012-05-15
• 專題

自1965年由英國的Bangham等⁽¹⁾首先發現磷脂在水中可以自發形成脂質體(Liposome)以來，對脂質體的實驗研究日漸廣泛，已遍及生命科學、膜工程學等領域，并逐漸向臨床應用發展。脂質體是由磷脂和其它兩親性物質分散于水中形成的由一層或多層同心脂質雙分子膜包封而成的球狀體，具有親水性和疏水性兩性性質。依其所含脂質雙分子層的層數，脂質體可分為單室脂質體和多室脂質體。其中單室脂質體又可根據粒徑的大小分為小單室脂質體(粒徑范圍0.02 ~0.08 μm)和大單室脂質體(粒徑范圍0.1~1μm)。

隨著生物膜色譜(Biomembrane Chromatography)的發展，脂質體作為一種分析工具受到了越來越多的關注，并成為近年來較為活躍的研究領域^(2,3)。生物膜色譜是一種新型液相色譜模式，它以天然或人工模擬生物膜為固定相，主要用來研究溶質分子與生物膜間的相互作用。目前，最常用的生物膜色譜固定相是固定化脂質體^(4-6)，因為它能更好地模擬生物膜的脂雙層結構，并具備生物膜的流動性特征。這種人工模擬的生物膜體系不僅可以精確地模擬生物膜的化學環境，而目其物理性能也可以通過調節溫度、pH、離子強度等得到有效控制。

固定化脂質體色譜具有許多優點，但是它的應用并不廣泛，主要原因是制柱比較困難、成本高。其次高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography ，HPLC)常用的硅膠基質及其化學鍵合固定相的pH適用范圍較窄(2~8)，色譜柱易被污染且難再生，流動相需要大量有機溶劑，成本較高，且污染環境。與固定化脂質體色譜相比，脂質體毛細管電泳(Liposome Capillary Electrophoresis ，LCE)更有優勢，其具有制備簡便、溶劑消耗少、進樣量小、成本低等優點。1995年Zhang等⁽⁷⁾首次提出了LCE的概念，近年來，LCE已經得到了較快發展，尤論是在方法學方面，還是在應用方面都有了比較深入的研究。

1脂質體的制備

目前，脂質體的制備技術己經相當成熟，有關報道和綜述也較多^(8-10)。常用脂質體制備方法有薄膜分散法、注入法、超聲分散法、冷凍干燥法、凍融法、逆相蒸發法、復乳法等。

LCE中所用的脂質體主要是單室脂質體。多室脂質體由于背景噪聲大，靈敏度低而不適合。與固定化脂質體色譜相比，LCE中的脂質體制備方法比較單一，通常采用薄膜-超聲分散法和薄膜-擠壓分散法。薄膜-超聲分散法是制備單室脂質體的最早方法，即將磷脂、膽固醇等類脂質溶于有機溶劑中，旋轉蒸發除去有機溶劑，使在燒瓶內壁形成薄膜，然后將水溶性介質加入燒瓶中并不斷振蕩，得到多室脂質體，最后經超聲處理得到單室脂質體，其粒徑大小依超聲時間的長短而不同。薄膜-超聲分散法的缺點是其制備的脂質體粒徑分布不太均勻，內層的磷脂分子數要小于外層的磷脂分子數，熱力學不穩定，脂質體之間容易發生融合⁽¹¹⁾。薄膜-擠壓分散法是目前制備單室脂質體的最常用方法。這種方法也是先采用薄膜法制得多室脂質體，然后在一定壓力(<7.091×l0⁵Pa)下使大多室脂質體通過很小孔徑的聚碳酸醋膜，以獲得大小均勻的單室脂質體⁽¹²⁾。

2 LCE的分類及脂質體涂層的制備

LCE大體可分為兩類。一類從電泳緩沖液入手，將脂質體作為添加劑，直接加入電泳緩沖液中，形成假固定相，其基本原理與膠束電動毛細管色譜(Micellar Electroliinetic Capillary Chromatography,MECC)類似，因而被稱之為“脂質體電動毛細管色譜(Liposome  Electrokinetic CapillaryChromatography LECC)" ^(7,13~21)。另一類從毛細管管壁入手，將脂質體作為涂層劑，采用氫鍵吸附法^(22~27)、靜電吸附法^(28,29)、抗生物素蛋白-生物素親和法⁽³⁰⁾等固定化方法，使毛細竹內壁形成較穩定的脂質體涂層，因而可稱之為“固定化脂質體毛細竹電泳(Immobilized Liposome Capillary Electrophoresis, ILCE) "。兩者相比，ILCE的柱效較低，但其脂質體的消耗少，并可與質譜聯用⁽²⁾。

ILCE的脂質體涂層是磷脂雙層(涂層在毛細管內壁的脂質體破裂，相互融合)還是囊泡層(涂層在毛細管內壁的脂質體形態完整)，取決于多種因素如脂質體的制備方法、粒徑大小、載體材料及濃度、電泳緩沖液中Ca²⁺存在與否等^(11,31,32)。脂質體涂層的穩定性與固定化方法有很大關系。氫鍵吸附法、靜電吸附法等非共價鍵合的方法，操作過程簡單，但脂質體涂層穩定性差，流失嚴重；親和法則使脂質體涂層的穩定性得到明顯改善，缺點是制作成本相對較高。下面對這些固定化方法進行一一介紹。

2.1氫鍵吸附法

該法十分簡便，只需將含有脂質體的電泳緩沖液與毛細管平衡數分鐘，此時由于脂質體中磷脂的一P=O基團與融熔石英毛細管內壁的硅烴基產生氫鍵作用力，而使脂質體充分吸附于毛細竹內壁，然后用不含脂質體的電泳緩沖液沖洗，除去未吸附的脂質體即可。但是對于負性脂質體而言，該法不太穩定，因為毛細管內壁的硅烴基會與負性脂質體發生相互排斥作用。

Hautala等⁽²²⁾選用平均粒徑大約100nm的大單室負性脂質體(組成成分:1-棕相酞-2-油酸-3-磷脂酞膽堿/磷脂酞妊氨酸/膽固醇，POPC/PS/Cholesterol)，通過氫鍵吸附法制備了LCE的脂質體涂層。具體涂層過程為：0.5mol/L鹽酸沖洗裸露熔融石英毛細管10min→水沖洗15min→電泳緩沖液沖洗5min→含有脂質體的電泳緩沖液沖洗10min→含有脂質體的電泳緩沖液在毛細竹內預穩定15min→電泳緩沖液沖洗除去未吸附的脂質體。在整個涂層過程中，電泳緩沖液的種類保持相同。Hautala等發現，脂質體涂層的最終效果和穩定性受到沖洗脂質體溶液的時間、分析電壓、電泳緩沖液的種類等因素的影響，其中電泳緩沖液的種類對負性脂質體涂層的涂層效果影響最大；采用三(三烴甲基氨基甲烷)緩沖液、磷酸欲緩沖液和麥黃酮(N-三烴甲基甲基甘氨酸)緩沖液制備的脂質體涂層，電滲流((EOF)有少許增加(1%~7%)，而用HEPES [N-(2-羥乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)]緩沖液制備的脂質體涂層，EOF減少24%，這表明在HEPES緩沖液中，脂質體與毛細竹內壁的作用最強，因而得到最好的涂層效果。Wiedmer等⁽²⁷⁾嘗試用一系列與HEPES結構相似的化合物(均含呱嗦基團)溶液作為電泳緩沖液，結果發現采用這些緩沖液制備的負性脂質體(組成成分：磷脂酞膽堿((PC)/PS)涂層也相當穩定。另外，在電泳緩沖液中加入一價金屬離了(如Ca²⁺，Mg²⁺，Zn²⁺)或電泳溫度在相變溫度以下時均能增加磷脂膜的剛性，提高脂質體涂層的穩定性^(24,25)。

2.2靜電吸附法

先將帶電荷的化合物涂布于毛細竹內壁，然后將帶相反電荷的脂質體填充于毛細竹中，則脂質體依靠靜電作用力吸附于毛細竹內壁。因為靜電作用力比氫鍵作用力大，所以這種方法制備的脂質體涂層比氫鍵吸附法制備的脂質體涂層更穩定一些。

Ornskov等⁽³⁰⁾先將瓊脂糖衍生物(含有帶正電荷的銨離了)涂布于毛細竹內壁，然后用含有負性脂質體(組成成分：POPC/PS)的溶液沖洗毛細管5min，則負性脂質體通過靜電作用力吸附在帶正電荷的毛細管內壁。實驗發現，隨著涂布于毛細管內壁的瓊脂糖衍生物電荷密度的增加，固定在毛細竹內壁的脂質體含量增大，一系列非離子化合物在ILCE中的保留值增大。這證明在脂質體的涂層過程中，靜電作用力確實起主要作用。

2. 3抗生物素蛋白一生物素親和法

首先將抗生物素蛋白共價鍵合到氨基化的毛細竹內壁，然后將生物素酞基化的脂質體填充到鍵合有抗生物素蛋白的毛細管內(如圖1)。通過抗生物素蛋白-生物素的親和作用力將脂質體固定在毛細管內表面。由于溶解脂質體的電泳緩沖液中含有抗生物素蛋白，因而單個生物素酞基化的脂質體之間也可通過親和作用力發生聚合。與氫鍵吸附法制備的脂質體涂層相比，親和法制備的脂質體涂層其穩定性有了相當程度的提高，因為抗生物素蛋白與生物素間的親和作用力比氫鍵作用力強得多。在涂層過程中還發現，毛細管內壁覆蓋了4~15層脂質體，且采用大單室脂質體制備的脂質體涂層所固定的磷脂含量要比采用小單室脂質體制備的脂質體涂層所固定的磷脂含量高出2倍。

3 LCE的應用

LCE的應用的應用領域主要分為二個方面：(1)在各種有機化合物及多膚、蛋白質分離中的應用；(2)在對映異構體分離中的應用；(3)在藥物一生物膜相4.作用研究中的應用。

3.1 LCE在各種有機化合物及多膚、蛋白質分離中的應用

LCE中，溶質的分離主要基于不同溶質在電泳緩沖液和脂質體 (LECC中為假固定相，ILCE中為涂層)之間的分配系數不同而進行的。溶質的帶電量、化學結構、極性、甚至濃度都會影響溶質的分配系數大小^(33,34)。另外，在分配過程中，不同溶質在脂質體中的分配部位也可能不同(極性區域或疏水區域) ⁽³⁵⁾。

目前，LCE已用于苯的衍生物及苯酚類化合物^{(14,15,18,25)}、類固醇^{(15~17,22,25)}、多膚和蛋白質^{(7,19~21,23,24,28)}、β-阻斷劑⁽¹⁸⁾、其它藥物^{(7,13,18,26,27)}等的分離。Wiedmer等^(16,17)在電泳緩沖液中添加負性脂質體分離了8種中性皮質類固醇化合物(17-異醛固酮、醛固酮、21-脫氧皮質醇、皮質酮、雄烯二酮、睪酮、黃體酮和17-烴孕酮)。脂質體中總脂質的含量、脂質體組成中不同磷脂的摩爾比、脂質頭部基團的種類、電泳緩沖液的種類以及脂質體的物理狀態(膠態和液品態)等多種因素都會影響分離效果⁽¹⁶⁾。Wiedmer等⁽¹⁷⁾分離衡體激素時還發現，脂質體組成成分中膽固醇的含量對類固醇化合物的分離有很大影響；膽固醇含量越高，化合物的分離度越大。

CE分離分析多膚和蛋白質時，樣品的吸附嚴重影響了分離分析結果的重現性。這種吸附主要是帶部分正電荷的多膚和蛋白質分子與帶負電荷的熔融石英毛細竹內壁相互作用的結果。而LCE分離分析多膚和蛋白質時，由于毛細竹內壁吸附了脂質體，硅烴基被掩蔽，樣品的吸附減少，因而使柱效增大，電泳峰形和分離分析結果的重現性明顯改善；同時，多肽、蛋白質與脂質體之間的相互作用使分離選擇性得到提高^(19,20,23)。 Corradini等^(19,20)在電泳緩沖液中添加POPC脂質體分別分離了4種堿性蛋白(細胞色素C，溶菌酶，核糖核酸酶A, a-胰凝乳蛋白酶原)和3種合成多膚(血管緊縮素I,Ⅱ,Ⅲ)；研究發現，毛細竹內注入的脂質體溶液的體積或脂質體載體材料(磷脂)的濃度增加，多膚的遷移時間都增加，分離度提高⁽²⁰⁾。Cunliffe等⁽²³⁾采用ILCE(脂質體組成：二月桂酞磷脂酞膽堿/Ca²⁺，DLPC/Ca²⁺)，在pH3~10范圍內成功分離了陰性和陽性蛋白質，理論塔板數高達1400000/m遷移時間的日內精密度小于1.3%，日間精密度小于4%，回收率達到93%以上。

3.2 LCE在對映異構體分離中的應用

在對映異構體的CE分離中，一般采用在電泳緩沖液中加入乎性試劑的方法。很多天然生物大分子如牛血清蛋白、人血清蛋白、糖蛋白、溶菌酶等本身含有不對稱碳原子，能夠對許多小分子化合物產生乎性識別作用，是一類高效、廉價、易得的乎性試劑⁽³⁶)。但是這類天然生物大分子在紫外光區都有強烈的吸收，因而大大限制了其應用范圍。將這類乎性試劑固定在毛細竹內壁是解決此問題的主要方法。Bo等⁽²⁸⁾首次將溶菌酶固定在毛細竹內壁脂質體涂層的磷脂膜上，在電泳緩沖液中不含乎性試劑的情況下，成功分離了D-和L-色氨酸。他們在涂層過程中發現，若將負性脂質體直接涂敷在裸露的毛細竹內壁，則涂層的穩定性很差。為解決該問題，Bo等先在毛細竹內壁涂敷M1C4(1-(4-碘丁基)-1,4-甲基哌嗪-1-碘化銨)，然后再涂敷負性脂質體，最后用溶菌酶溶液沖洗涂層后的毛細竹。因為 M1C4掩蔽了帶負電荷的硅經基，減少了負性脂質體與硅經基的排斥作用，而目與負性脂質體靜電相吸，所以脂質體涂層的穩定性大大提高。溶菌酶由于較易滲入到磷脂膜內，而被比較穩定地固定于毛細竹內壁。與此同時，Bo等還嘗試將M1C4涂敷于毛細竹內壁后直接涂敷溶菌酶，雖然D-和L-色氨酸的分離度提高了，但卻以犧牲穩定性為代價，分離結果的重現性很差。

3.3  LCE在藥物與生物膜相互作用研究中的應用

藥物在體內的吸收、分布和排泄統稱為藥物轉運，而在體內發生的化學變化，則稱為藥物代謝或生物轉化。在這些過程中，各種因素的相互影響如圖2所示⁽³⁷⁾。因為人體內的各部分之間彼此有生物膜隔開，所以生物膜是影響藥物體內過程的最主要因素之一。藥物的活性、毒性、體內分布及其它生理過程都與藥物在生物膜上的分配狀況相關⁽³⁸⁾，因此測定藥物在生物膜上的分配系數對藥物設計和藥物篩選來說十分重要。由于LCE提供了一個人工模擬的生物膜表面，能夠模擬藥物結合到生物膜表面或分配到生物膜脂雙層時發生的疏水、靜電等相互作用，因而藥物在LCE中的遷移行為和選擇性能夠直接反映藥物在生物膜上的分配狀況。

藥物在LCE中的遷移行為取決于EOF、藥物與脂雙層的相互作用、磷脂(或其它脂類尤其是膽固醇與磷脂的比例)的用量等諸多因素。為了表示藥物與脂雙層的相互作用，可參照色譜原理，假定一個與EOF和磷脂的用量無關的容量因子(見式((1))⁽⁷⁾。

               k'=(t- t') /( t'×B)                                  (1)

式中k'為容量因子；t為藥物在脂質體毛細竹電泳中的遷移時間；t'為藥物在無脂質體毛細竹電泳中的遷移時間；B為磷脂的用量。

通過式(2)還可以將藥物在LCE中的容量因子k'與藥物的脂質體一水分配系數K_1w聯系起來。

                    k'=φK_1w                           (2)                               

式中φ為相比，等于LCE中脂質體與電泳緩沖液所占的體積比。

一個藥物在生物膜上的分配情況通常用該藥物在正辛醇和水中濃度比值的對數(lgP_ow)來衡量^(19,39)。然而正辛醇與生物膜有很大差異，用lgPow評價藥物與生物膜的相互作用是不夠準確的。脂質體的結構與生物膜很相似，因此，K_1w能更準確地反映藥物與生物膜的相互作用。

由式(2)可知，K_1w與相比φ有關。在LCE中，φ是一個反映脂質體本質特征的參數，當脂質體的組成恒定時，φ不變，且能較準確地計算出來。在HPLC中，φ是固定相與流動相所占的體積比，因而不同的色譜柱，φ的差異性很大，且不易計算⁽¹⁸⁾。因此，與固定化脂質體色譜相比，采用LCE測定K_1w更準確，重現性更好。

Burns等(14,18)首次將LCE技術應用于定量測定藥物的K_1w。研究表明，LCE測定的K_1w與lgP_ow、線性溶劑化能量關系式(Linear Solvation Energy Relationship, LSER}是定量結構分配關系的一種表現形式)所預測的化合物的K_1w值都有很好的相關性。這說明脂質體的溶劑化特性與正辛醇相似，并且K_1w還可應用于定量結構分配關系(Quantitative Structure-Partition Relationship, QSPR)方面的研究。

藥物的吉布斯自由能變化△G^o即藥物在無脂質體毛細竹內的吉布斯自由能與在脂質體毛細竹內的吉布斯自由能之差，是評價藥物與生物膜間相互作用的另一個重要參數^(7,13,26)?！鱃^o越小，說明藥物與生物膜間的相互作用越強，藥物更易進入生物膜內。但△G^o的計算公式比較復雜，為此，通常選擇一種參比藥物(如阿司匹林)，并假設EOF為零，通過計算0(OCe>見式(3)來衡量藥物的△G^o(7)。

式中R_g為標準氣體常數；T為熱力學溫度；t₁為參比藥物在脂質體毛細管電泳中的遷移時間；t_1’為參比藥物在無脂質體毛細管電泳中的遷移時間；t₂為被測藥物在脂質體毛細竹電泳中的遷移時間；t_2’為被測藥物在無脂質體毛細竹電泳中的遷移時間。

Manetto等^(13,26)分別采用LECC和ILCE(脂質體組成成分：POPC)測定了一系列不同極性藥物的△(△G^o)，對這些藥物與脂質體間的相互作用進行了探討，并比較了兩種方法測定結果的差異性。在LECC中，他們選用聚酞亞胺涂層毛細竹(總長30cm，有效長度19.5cm，內徑50μm)，樣品從負極端進樣；電泳緩沖液pH9.2時，水楊酸、阿司匹林、酮基布洛芬、苯妥英和普蔡洛爾5種藥物全部與脂質體發生相互作用，但測得的水楊酸的△(△G^o)值比文獻[7](采用LECC)測得的水楊酸的△(△G^o)值低0.2 kJ/mol(約17%) ，可能因為電泳緩沖液pH9.2時仍有殘留的EOF而導致測定結果偏低，因為扣除EOF后計算得到的△(△G^o)與文獻[7]的測得值很接近⁽¹³⁾。在ILCE中，選用未涂層的毛細竹，測得的水楊酸的從△(△G^o)值(扣除了EOF的影響)比LECC測得的值高出5%⁽²⁶⁾。

一般來說，在利用LCE研究藥物與生物膜的相互作用時，為了使脂質體與人體生物膜具有更大的相似性，電泳緩沖液pH的選擇應依據相應的人體生理pH(如小腸中生理pH約5.4，細胞外生理pH約7.0，細胞內生理pH7.4)而定。另外，由于pH會影響脂質體載體材料的水解速度(pH過大或過小，磷脂的水解速度都將增大⁽⁴⁰⁾，因此LCE應使用新鮮制備的脂質體。

4展望

LCE作為一種新穎的分離分析方法，目前僅有相關的研究報道。LCE除在分離分析方面具有一定潛力外，更重要的是脂質體與生物膜結構類似，利用LCE研究藥物與脂質體間的相互作用，能最大程度地反映藥物分子與生物膜相互作用的真實情況。這種體外實驗模擬體內條件的篩選模型為藥物篩選和藥物設計提供了強有力的工具。再者，LCE與生物膜色譜相比，方法簡單，可操作性強，成本低廉，尤其是測定藥物的K_1w準確、重現性好，具有更好的發展前景。目前，LCE無論在理論還是技術方面都還不太成熟，應用范圍也較為有限，因而其發展空間還很廣闊。

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注：本文為提供者整理翻譯，由于知識所限，其中錯誤在所難免，敬請原諒。如有問題可以查找原文。