二聚超氧化物歧化酶的結(jié)構(gòu)性變換和肌萎縮性側(cè)索硬化癥

• 2012-11-06
• 專題

1.肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS) 和突變型超氧化物歧化酶(SOD)

肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)是一種漸進(jìn)的麻痹性疾病，其特點(diǎn)是上下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元選擇性退化。^1,2)雖然ALS是一個(gè)顯著的偶發(fā)性疾病，但是~10%的案例是常染色體顯性遺傳(家族性ALS(fALS))和部分fALS案例是由SOD1基因突變導(dǎo)致的。^3,4)SOD1產(chǎn)品基因,細(xì)胞質(zhì)Cu,Zn-超氧化物歧化酶(SOD1),是一種廣泛表達(dá)酶，能夠催化超氧自由基歧化反應(yīng)。⁵⁾

SOD(Cu/Zn)的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)確認(rèn),⁸⁾ Fig.1 (PDB, 1spd_x)所示它的二聚體結(jié)構(gòu)。銅和鋅通過組氨酸咪唑環(huán)陰離子的連接在一起。

一些數(shù)據(jù)表明：SOD1突變的結(jié)果除了功能缺失導(dǎo)致肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)以外，還有另外的結(jié)果。例如，一些fALS-相關(guān)的突變體SOD1s保留了完整的酶活性。⁶⁾此外，SOD1能夠?qū)е滦∈笫ブX，不顯示ALS癥狀，然而轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出fALS-相關(guān)突變體G93A SOD1延伸性ALS-類似癥狀盡管也有內(nèi)源性小鼠SOD1表現(xiàn)。⁷⁾最終在這個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠試驗(yàn)中過表達(dá)人類野生型SOD1的失敗用于緩解ALS癥狀。⁷⁾

一種假設(shè)解釋說SOD1功能性的收獲是突變體的錯(cuò)折疊改變了其催化機(jī)制，從而允許了過氧亞硝酸鹽⁹⁾和有可能的過氧化氫生成。¹⁰⁾另外一個(gè)重要的假說認(rèn)為這個(gè)毒性源于SOD1細(xì)胞內(nèi)聚集體。SOD1包涵體，與anti-抗體反應(yīng)，是ALS 患者常見的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和附近的星形膠質(zhì)細(xì)胞供給體。¹¹⁾

然而，當(dāng)我們考慮到蛋白質(zhì)氧化鈣性有助于聚集體和蛋白酶抵抗力的時(shí)候，這兩種假設(shè)也不是相互排斥的。蛋白質(zhì)聚集是很多種神經(jīng)性失常變性疾病的病理性特征，¹²⁾包括Huntington’s，Alzheimer’s和 Parkinson’s等疾病。每一種情況下，SOD1s 突變體錯(cuò)折疊和聚合傾向的可能性原理通過超過100不同的突變導(dǎo)致一個(gè)常見的表現(xiàn)型。盡管SOD1聚集體可能有的內(nèi)在毒性或者是通過螯合分子伴侶導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元毒性阻礙了蛋白酶的正常運(yùn)作，但是SOD1聚集體的毒性起源尚未明確。

要了解ALS的發(fā)病機(jī)制，我們必須弄清楚如何改變SOD分子能誘導(dǎo)分子的損傷。為了進(jìn)行這樣的調(diào)查，我們已經(jīng)開始弄清楚了功能增益的原因和SOD聚集體在溶液中的機(jī)制。

SOD1的反應(yīng)機(jī)制已經(jīng)被許多學(xué)者進(jìn)行了研究。最近Nishida等人對(duì)于這種酶基于通過使用模型化合物所得的結(jié)果有了一個(gè)新的假設(shè)機(jī)制。¹³⁾在上述第二步驟中 (2)我們已經(jīng)指出了Cu--OOH形式的中間體形成的重要性(見圖表-I)，這種過氧化氫能夠從野生型酶中立即祛除，因?yàn)檫^氧化氫和copper(II)離子與周圍的有機(jī)基團(tuán)分子間作用基本上可以忽略不計(jì)。

Siddique等人⁷⁾已經(jīng)確定了人類SOD的晶體結(jié)構(gòu)，還有另外兩種SOD結(jié)構(gòu)，并且已經(jīng)確定fALS突變不能改變?nèi)魏位钚渣c(diǎn)的殘基包括基質(zhì)中的靜電識(shí)別，金屬離子的結(jié)扎或者是活性點(diǎn)通道的形成，但是能夠檢測(cè)到銅離子(Ⅱ)周圍細(xì)微的變化。基于準(zhǔn)確研究典型結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)中疏水材料的積極影響的基礎(chǔ)上，6個(gè)fALS突變體有可能破壞亞單位折疊或者二聚體結(jié)構(gòu)。但是，我并不認(rèn)為這些對(duì)亞單位折疊或者二聚體結(jié)構(gòu)的破壞性影響可以足夠的解釋所有fALS 發(fā)病原因。

1997年, Yim等人報(bào)道了一個(gè)fALS 突變體(Gly93Ala=G93A)表現(xiàn)增強(qiáng)自由基生成活性的作用， 而它的歧化活性與野生型酶一樣。¹⁴⁾圖2為含有H₂O₂和人SOD 酶溶液中DMPO-OH radical加成物生成物ESR 波譜。據(jù)他們報(bào)道，突變體中自由基生成的活性，在低濃度H₂O₂條件下通過自旋捕捉法，相對(duì)于wild-type和G93A活性是增強(qiáng)的，wild-type<G93A<A4V，但是上述觀測(cè)到的原因還沒有詳盡的描述。

2. “增益功能”SOD酶起源與Cu(II)-過氧化氫加合物獨(dú)特的反應(yīng)性能

為了得到SOD突變體結(jié)構(gòu)變化和fALS發(fā)病機(jī)制之間相關(guān)的一個(gè)全面的解決方案，我們研究了Cu(II)-OOH的反應(yīng)性能，用來作為一個(gè)SOD反應(yīng)中的重要中間體。為了這個(gè)目的，我們已經(jīng)合成了很多種Cu(II)化合物，這種化合物都含有N,N-雙(2-吡啶甲基)胺配體，如圖3所示。¹⁵⁾所有的Cu(II)化合物結(jié)構(gòu)特點(diǎn)都十分相似(作為例子, [Cu(bdpg)Cl]+晶體結(jié)構(gòu)如圖4所示)。在過氧化氫的參與下，預(yù)期生成了加成產(chǎn)物如圖4右邊所示，這個(gè)結(jié)果與用環(huán)己烷等反應(yīng)一致，并且我們發(fā)現(xiàn)Cu(II)化合物過氧化物加合物的反應(yīng)性能高度依賴于配體系統(tǒng)中的R，這是因?yàn)橄到y(tǒng)中不同的導(dǎo)致Cu(II)離子周圍細(xì)微的結(jié)構(gòu)變化的結(jié)果。

我們已經(jīng)測(cè)定了含有Cu(II)絡(luò)合物和自旋捕捉試劑溶液的ESR波譜，例如PBN(α-苯基-N-叔丁基氮氧化物)和TMPN (N,N,N',N'-四甲基-4-哌啶醇), 分別用于OH自由基和單重氮(1?g)(圖表-II)的特定試劑。¹⁶⁾當(dāng)Cu(II) (tpa) (=三(2-吡啶甲基)胺)或者(bdpg)絡(luò)合物與H₂O₂和PBN混合時(shí)，由于PBN自由基的生成，我們檢測(cè)不到ESR信號(hào)。然而，溶液中含有Cu(tpa)絡(luò)合物的情況下，由于TMPN (圖表-II )相應(yīng)的硝酸自由基的生成，我們能夠檢測(cè)到強(qiáng)峰，含有Cu(bdpg)絡(luò)合物的溶液則沒有這種情況。尤其是在做Cu(pipy)Cl⁺和Cu(mopy)Cl⁺之間的比較時(shí)非常有趣。¹⁵⁾這兩種化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)非常相似，除了Cu(mopy)Cl⁺絡(luò)合物morphorin 環(huán)上的氧原子被替換成了Cu(pipy)Cl⁺絡(luò)合物上面的-CH2的差別(見下圖)。

Cu(pipy)Cl⁺過氧化氫參與條件下, 我們觀測(cè)不到硝酮自由基的形成。與此相反，由Cu(mopy)Cl⁺ 絡(luò)合物生成的自由基能夠檢測(cè)到有很高的活性，如圖5。在Cu(II)[Cu(Hphpy)Cl]⁺絡(luò)合物里面我們也觀測(cè)到了類似的高活性的TMPN 自由基的生成。這種情況下，類似的Cu(mopy)Cl⁺ 絡(luò)合物, 在Cu(II)溶液中加入H₂O₂，由于銅離子的原因，誘導(dǎo)不了ESR spectrum發(fā)生變化；但是添加TMPN 會(huì)導(dǎo)致ESR 信號(hào)屬性發(fā)生急劇的變化( i.e. , 由于銅原子發(fā)生超精細(xì)結(jié)構(gòu)變化)。上述這些所有的假設(shè)是建立在當(dāng)三種試劑存在于溶液中的時(shí)候Cu(II)絡(luò)合物、過氧化氫、TMPN的發(fā)生(見圖6), 當(dāng)溶液中中間物形成時(shí)可以觀測(cè)到過氧化氫獨(dú)特的反應(yīng)性能。

以上事實(shí)表明Cu(II)-OOH的反應(yīng)性能是由中間體的結(jié)構(gòu)性質(zhì)所決定的(見圖6)i.e. , 通過Cu(II)-OOH，外圍基團(tuán)和基材之間的相互作用而得。¹³⁾在這里應(yīng)當(dāng)指出雖然過氧化氫被認(rèn)為相對(duì)惰性且對(duì)細(xì)胞無毒，但是我們目前的結(jié)果明確的表明某些Cu(II)螯合物可以激活過氧化氫，表現(xiàn)出類似于單重氮(¹?g)的高活性。

為了進(jìn)一步獲得Cu(II)-OOH物種反應(yīng)性能，我們已經(jīng)測(cè)得了Cu(II)化合物和過氧化氫溶液的ESI-質(zhì)譜。當(dāng)Cu(Me-bdpg)Cl溶液中加入過氧化氫(見圖3),由ESI-質(zhì)譜測(cè)得生成了[Cu(bdpg)Cl],而不是[Cu(dpal)]。¹⁷⁾這些都清楚的表明Cu(II)-OOH物種能夠切割氧化縮氨酸C-N鍵，而不是水解，因?yàn)橐驗(yàn)樗鈹嗔丫涂赡軓腃u(Me-bdpg)化合物中得到Cu(dpal)種。

我們還發(fā)現(xiàn)某些Cu(II)絡(luò)合物在過氧化氫的存在下，蛋白質(zhì)發(fā)生分解，在淀粉樣蛋白beta-肽(1-40)蛋氨酸殘基的氧合硫原子¹⁸⁾處顯示出很高的活性。¹⁹⁾所有的事實(shí)可能表明突變型SOD 的“增益功能”是由于在SOD 反應(yīng)進(jìn)程中有一個(gè)長久的高活性的Cu(II)-OOH作為中間體形成。突變型SODCu(II)周圍的結(jié)構(gòu)發(fā)生很大的變化，這給Cu(II)-OOH的反應(yīng)能行了一個(gè)意想不到的影響，正如我們文件所觀測(cè)到的。通過Cu(II)-OOH突變型SOD的C-N 鍵的斷裂使得SOD表面發(fā)生很大的變化，形成SOD 酶不穩(wěn)定的二聚體。²⁰⁾因此，具有高反應(yīng)性Cu(II)-OOH 基團(tuán)的形成和存在很有可能是fALS 發(fā)病機(jī)制中氧化應(yīng)激的一個(gè)內(nèi)在起源，這與我們最近的含有SOD酶的不穩(wěn)定性二聚體的研究有一定的關(guān)聯(lián)。^21,22)

3二聚體SOD分子分解成單體

如前文所述，蛋白質(zhì)聚集被廣泛的認(rèn)為是很多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病一個(gè)常見的病理性特征，包括Huntington’s, Alzheimer’s, and Parkinson’s 等疾病，SOD1聚集體本身的毒性或者是由螯合分子伴侶阻礙蛋白酶體正常的功能運(yùn)作所產(chǎn)生的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元毒性所致。

2004年, Rakhit 等人報(bào)道了SOD1通常是一個(gè)二聚體酶，即單體解離之前野生型和突變體蛋白的集合體。²³⁾他們使用“Dynamic Light Scattering (DLS)”方法了檢測(cè)二聚體SOD 的單體解離。最近我們也曾報(bào)道了毛細(xì)管電泳法(CE)是非常適合進(jìn)行調(diào)查研究蛋白質(zhì)構(gòu)象變化和蛋白質(zhì)在溶液中的聚集狀態(tài)的一個(gè)方法。²⁴⁾舉一個(gè)例子，圖6顯示兩個(gè)SOD 和運(yùn)鐵蛋白的CE曲線圖。²⁵⁾盡管這兩種酶的濃度時(shí)相同的，但是他們的峰的強(qiáng)度彼此有很大的不同，這個(gè)已經(jīng)被合理化的事實(shí)是因?yàn)槿芤褐蠸OD 具有一個(gè)剛性二聚體結(jié)構(gòu)，而apo-運(yùn)鐵蛋白二聚體結(jié)構(gòu)更為靈活。²⁶⁾

如圖7所示當(dāng)Cu(II)/抗壞血酸溶液中加入SOD分子的時(shí)候，由于二聚體SOD的生成，我們可以觀測(cè)到峰值強(qiáng)度急劇下降；我們的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)和Rakhit 等人報(bào)道是一樣的。這就清楚的表明二聚體SOD分子的解離可以通過CE法很容易的檢測(cè)到。

我們也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)過量的過氧化氫導(dǎo)致SOD分子二聚體結(jié)構(gòu)出現(xiàn)松動(dòng)或者是解離。²⁶⁾過氧化氫的參與是二聚體SOD 解離的起源是很明確的，²⁶⁾ Kakhit等人很有可能在系統(tǒng)中使用的氧化劑為過氧化氫，偶發(fā)性ALS很可能與過氧化氫的存在有關(guān)，同樣的討論也可以應(yīng)用于偶發(fā)性朊病毒病的闡述。

通過使用抗體的方法來迅速的純化SOD1，并且用質(zhì)樸分析法進(jìn)行耦合連接，Sato等人已經(jīng)在29 SOD1-突變fALS 患者身上檢測(cè)出了 其紅細(xì)胞野生型和突變型SOD1相對(duì)積累水平。²²⁾他們觀測(cè)到檢測(cè)不到SOD1突變體的患者持續(xù)疾病時(shí)間最短。盡管疾病發(fā)病年齡與SOD1突變體的數(shù)量沒有直接的關(guān)系，但是令人信服的是它顯示了疾病時(shí)間與突變體積累的一個(gè)很強(qiáng)的逆相關(guān)系。換句話來說，不太穩(wěn)定的突變體被發(fā)現(xiàn)可能加速病情進(jìn)展。這一令人驚奇的發(fā)現(xiàn)意味著盡管錯(cuò)誤折疊的SOD1突變體的不穩(wěn)定形式加劇了疾病潛在毒性的進(jìn)展，但是SOD1 突變體穩(wěn)定性與疾病發(fā)病沒有一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系。因此SOD1二聚體分子分裂成為錯(cuò)誤折疊單體應(yīng)該會(huì)是APS 發(fā)病機(jī)制過程中必不可少的重要步驟。很明顯過氧化氫在SOD1單體²⁶⁾形成的過程中起了一個(gè)很重要的作用，所以我們應(yīng)該注意到人體中過量的過氧化氫的生成，特別是二聚體(III)與谷胱甘肽環(huán)和其他相關(guān)的系統(tǒng)。²⁷⁾

 4.偶發(fā)性朊病毒病Cu(II)-OOH

在英國，1980年到大約1996年之間，大約有750,000 牛感染了BSE (牛海綿狀腦病，傳染性海綿狀腦病之一)的牛被屠宰供人類食用，目前人們公認(rèn)為TSEs 中心部分是將正常的細(xì)胞朊蛋白(PrP^C)翻譯轉(zhuǎn)化為一個(gè)非正常的的亞型癢病PrP (PrP^Sc)，這種疾病具有一個(gè)高-β-折疊片段內(nèi)容并且與傳染性疾病有關(guān)。²⁸⁾人們普遍的認(rèn)為PrP^C是一種含銅蛋白 (在N-末端的非結(jié)構(gòu)化區(qū)域至多有4個(gè)銅離子具有八面體重復(fù)部位)。小鼠和雞PrP^C的重組體的研究分析隨著PrP^C銅絡(luò)合物的形成使我們得到了一個(gè)“增益功能”的重要發(fā)現(xiàn)；PrP^C 已經(jīng)被證明有助于直接影響細(xì)胞SOD 活性的功能。

錯(cuò)誤折疊朊蛋白 (PrP^Sc) 最終殺死充滿大腦中類似于海綿一樣的神經(jīng)元和葉狀物。除了PrP^Sc以外, 還有另外一個(gè)從受影響的腦中萃取出來的耐蛋白酶PrP(27-30 kDa), 被叫做PrP27-30。在這里應(yīng)該注意的是PrP27-30 唯一來自于PrP^Sc(而不是PrP^C), 這個(gè)和PrP^C至PrP^Sc直接已經(jīng)確定順序的氨基酸沒有差別。基于這些事實(shí)，我們可以假定，PrP^Sc銅離子周圍的化學(xué)環(huán)境應(yīng)該和PrP^C是有所不同的；這種情況和野生型與突變型SOD酶銅離子周圍出現(xiàn)的差異性相似。因此，PrP^Sc的“增益功能”很有可能歸因于“高活性”Cu(II)-OOH 結(jié)構(gòu)可能發(fā)生如描述中的突變體SOD分子，導(dǎo)致在銅離子周圍的肽鍵發(fā)生斷裂(大約在90 site處), 然后得到危險(xiǎn)的PrP27-30;后面的蛋白質(zhì)就可能比較類似錯(cuò)誤折疊SOD單體。除了這一點(diǎn)兒以外，PrP^C和PrP^Sc 中的銅離子很有可能與過氧化氫反應(yīng)得到Cu(II)-OOH類產(chǎn)物，這很有可能嚴(yán)重影響到PrP^C 譬如甲硫氨酸殘基的氧合，構(gòu)象的變化(即PrP^Sc的形成), 以及過氧化氫參與下蛋白質(zhì)的降解(見圖表-III)。天然朊蛋白^29-32)中觀測(cè)到的幾個(gè)實(shí)驗(yàn)事實(shí)與我們的討論是一致的。所有的這些研究結(jié)果都支持著我們的提案，來源于PrPSc SOD功能結(jié)構(gòu)和代謝異常的鐵離子²⁷⁾的過氧化氫很有可能是零星朊病毒疾病氧化應(yīng)激力的真正來源。

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